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細胞污染問題分析與解決

 更新時間:2020-10-15 點擊量:1175

 

細胞污染問題分析解決

細胞轉染時,細胞狀態(tài)的好壞對轉染效率有很大影響。細胞污染可能會導致細胞死亡,本文主要總結了細胞培養(yǎng)中常見污染現(xiàn)象和解決方法。

凡是對細胞生長有危害的成分或者造成細胞不純的異物都視為污染。細胞污染根據(jù)污染源可以分為化學污染,物理污染和生物污染。本文主要描述微生物污染的現(xiàn)象及解決方法

微生物污染

1. 細菌:細菌污染常見的有大腸桿菌,葡萄球菌等。細菌污染較易發(fā)現(xiàn),在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀,培養(yǎng)液一般會在短時間內變黃,有時靜置的培養(yǎng)液不混,稍加震蕩,變會有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮,有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在,細胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。

處理:① 在培養(yǎng)液中加入相應的抗生素,能夠預防絕大多數(shù)的細菌污染

②保證器皿、水充分滅菌,空氣無菌,同時保證滅菌壓力。
2、霉菌:霉菌的污染多數(shù)是白色念珠菌, 曲霉菌,酵母菌等。霉菌污染后培養(yǎng)液短期內依舊清亮不變渾濁,倒置顯微鏡下可看見細胞之間有交錯的絲狀,樹枝狀菌絲,漂浮在培養(yǎng)液中。念珠菌呈卵圓狀,在細胞周邊生長。細胞被霉菌污染后,仍可生長,長時間細胞的活力狀態(tài)會變差。

           

處理:先確定污染物的種類:細菌、真菌還是支原體。如果是霉菌污染。迅速將污染細胞與正常細胞系隔離,并對實驗中所用過的所有器皿工具消毒

3、支原體:支原體的大小介于細菌和病毒之間,是一種獨立生活的微生物。對熱敏感,對一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變,多吸附在細胞表面和細胞之間。電鏡下觀察,中心有高密度的密集顆粒,橫斷面與細胞微絨毛相似。

因國內的血清很多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測,而支原體又是牛血清中常見的微生物之一。支原體污染細胞后,培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁.但細胞變化不顯著,在細胞逐漸的培養(yǎng)中,細胞會慢慢死亡。

支原體污染檢測:

熒光染色法:DNA和與DNA特異性結合的熒光染料結合,使得支原體的DNA著色,然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。

 

解決:① 抗生素排除法:支原體污染預防比解決好。如果不小心污染后,可加入高濃度抗生素(常規(guī)使用的5倍濃度)作用24-48小時,再換入常規(guī)培養(yǎng)液,但該法不保證有效。推薦用量:慶大霉素 200ug/ml ,四環(huán)素10ug/ml ,卡那霉素50ug/ml 。

2 加溫除菌:支原體不耐熱,可以對支原體污染的細胞熱處理除菌。將支原體污染的細胞放置41度中作用10小時可殺死支原體。因高溫對細胞本身也會產(chǎn)生一定影響,故熱處理前需行預實驗,確定對細胞影響小而能大程度的殺死支原體的時間。
4、黑蛟蟲:黑膠蟲污染后細胞中出現(xiàn)小黑點,高倍鏡下可看見不規(guī)則的運動。培養(yǎng)液渾濁不明顯,對細胞生長狀態(tài)無太大影響。

解決:如果細胞出現(xiàn)黑膠蟲污染,可增加細胞的接種密度,提高細胞存活率。當細胞生長狀態(tài)很好時,黑膠蟲的數(shù)量會降低。細胞培養(yǎng)過程中堅持要每天換液,并用緩沖液沖洗,能夠大大降低黑膠蟲的數(shù)量,可終消失,偶爾在鏡下可見個別小黑點,但整體細胞培養(yǎng)和后續(xù)的細胞轉染無影響。

細胞培養(yǎng)箱染菌清洗方法

用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內,再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅?;蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有細胞暫時轉移,采用過氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。并把過氧乙酸放置在孵箱內一個小時,使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后,再移入細胞。孵箱應定期清潔(2月左右)。
其它培養(yǎng)箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外燈照。
預防霉菌污染,可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗;但細胞一旦污染,制霉菌素或放線菌素D或雙抗都無法彌補,舍棄被污染細胞,并將環(huán)境*消毒。如果所有細胞都污染,可能是整體系統(tǒng)污染,檢查所有培養(yǎng)基和器材,并重新滅菌。針對個別污染,先考慮操作問題,注意操作規(guī)范。

 

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