各種轉染試劑中文說明
1.細胞接種:細胞密度 2-6 x106 cells/mL.
2.質(zhì)粒的準備:在 5%最終培養(yǎng)體積的 DMEM 或培養(yǎng)基中,每 10 6 個細胞稀釋1.0 ug pDNA。
3. PEI 的準備:在 5%最終培養(yǎng)體積的 DMEM 或培養(yǎng)基中,每 10 6 個細胞稀釋3.0 ug PEI Prime,混勻通過快速,短暫渦旋或顛倒數(shù)次試管,將 pDNA 和 PEI Prime 溶液混合在一起。
4. 使 pDNA 和 PEI 的混合物在室溫下靜置 10 分鐘。一邊旋轉板,一邊將 pDNA 和 PEI 混合物逐漸滴加到細胞中。
5.于 37℃ CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
二、Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 轉染步驟:
說明:以下步驟適用于在 6 孔培養(yǎng)板中轉染貼壁細胞。開始時,每 6 孔培養(yǎng)板使用 0.4ug DNA。盡管 DNA 的量看起來很少,但已足夠用于轉染。如果想獲得最高的轉染效率,對每種細胞系的轉染條件都要進行優(yōu)化。
轉染前一天,用 5ml 含血清和抗生素的培養(yǎng)基分裝使每 6 孔培養(yǎng)板含 2-8×105的細胞(根據(jù)細胞類型而定)。在細胞的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)(通常 37℃和 5%CO2)。轉染當天細胞應 40-80%融合。轉染時,用 DNA 濃縮緩沖液(EC Buffer)稀釋 1ug DNA 至 100ul 總體積(DNA 用 pH 7-8 的 TE Buffer 溶解,DNA 濃度:0.1ug/ul)。加入 3.2ul Enhancer, 渦旋 1s 以混合溶液。
重要:請保持 DNA 與 Enhancer 比例恒定。
注意:質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量會顯著影響幾個轉染參數(shù)如轉染效率、細胞增殖和細胞毒性、以及對于結果的解釋。因此,只應該使用最高純度的 DNA。室溫(15-25℃)孵育 2-5 分鐘,離心(spin down)幾秒鐘以從管頂去除液滴。向 DNA-Enhance 混合液中加入 10ul Effectene Transfection Reagent,反復吸取 5
次或渦旋 10 秒鐘以混合。
注意:沒必要一直把 Effectene Reagent 置于冰上。在室溫中放置 10-15 分鐘不會改變它的穩(wěn)定性。
室溫下(15-25℃)孵育 5-10 分鐘以形成轉染復合物。孵育過程中,從培養(yǎng)板上輕柔地吸出培養(yǎng)液,用 4ml PBS 洗滌一次細胞。加入1.6ml 新鮮培養(yǎng)液(可以包含血清和抗生素)到細胞中。加入 0.6ml 培養(yǎng)液(可以包含血清和抗生素)至包含轉染轉染復合物的 EP 管中。吸取兩次以混合,立即將轉染復合物 drop-wise 加入 6 孔培養(yǎng)板的細胞中。輕搖培養(yǎng)板使轉染復合物分布均勻。將細胞與轉染復合物在它們的正常培養(yǎng)條件下孵育適當?shù)臅r間直至轉染基因表達。孵育時間和由所采用的實驗和所使用的基因決定。
Optional: 大多數(shù)情況下,不需去除轉染復合物。然而,如果觀察到細胞毒性,則需在轉染后 6-18 小時移除 Effectene-DNA 混合物,用 PBS 洗滌一次細胞, 然后加入 5ml 新鮮細胞培養(yǎng)液。
瞬時轉染時,進一步試驗分析轉染基因的表達。
轉染β-gal 或 cat 報告基因的重組子常在轉染后孵育 24-48 小時以使轉染基因的表達。
穩(wěn)定轉染時,在轉染后 24-48 小時,將細胞以 1:5~1:10 傳代至合適的選擇性培養(yǎng)基中。保持細胞在選擇性培養(yǎng)基中直至克隆出現(xiàn)。
注意:我們推薦對每一細胞系和使用的抗生素建立一個致死曲線(劑量-反應曲線)。但是一定要記住致死曲線受細胞密度的影響。
以下步驟有時是必須的:將轉染的細胞置于它們正常的培養(yǎng)液(如:不含選擇性抗生素的培養(yǎng)液),然后孵育 1-2 天,然后再加入選擇性培養(yǎng)液。